PMC

Modèles de la conversion de la PrPc en PrPsc , . A. Modèle de polymérisation assistée par une amorce. B. Modèle de nucléation-polymérisation.

Variations de la fréquence cardiaque quotidienne moyenne (battements par minute [BPM]) et de l’alanine aminotransférase (ALT; unités/L) de la première journée d’hospitalisation au moment du congé. Nous avons amorcé le traitement au remdésivir au jour 2 et l’avons interrompu au jour 5.

Principes du séquençage selon la méthode de Sanger. Après dénaturation du produit amplifié par séquençage, l’un des deux brins (ici, le brin sens) s’hybride à une amorce spécifique. Pour la simplicité du schéma, nous avons pris une amorce de 5 pb, la taille habituelle des amorces étant de 20 pb environ. Le mélange réactionnel contient, outre les tampons et l’ADN polymérase, des déoxynucléotides triphosphates (dNTP, dA-, dC-, dG-, dT-TP) mais aussi des didéoxynucléotides triphosphates (ddNTP, ddA-, ddC-, ddG-, ddT-TP). L’incorporation aléatoire d’un ddNTP à la place d’un dNTP ne permet plus la polymérisation par l’ADN polymérase. L’extension s’arrête. À la fin de la réaction de séquence effectuée selon des cycles thermiques identiques à ceux de la PCR (on parle de PCR asymétrique, une seule amorce étant utilisée au lieu de deux), nous avons des fragments de taille différente. Ces fragments sont soumis à migration dans un champs électrique. Il s’agit le plus souvent d’une électrophorèse capillaire. Chaque ddNTP étant marqué par un fluorophore différent, un signal lumineux sera généré, spécifique de la base didéoxy incorporée. Les fragments étant de taille différente et la résolution allant jusqu’à une base de différence, il sera simple de recueillir ce signal et en déduire la séquence. Les signaux lumineux sont analysés par un logiciel spécifique, et le résultat de l’analyse peut être lu, par exemple, sous forme d’un électrophorégramme de lecture facile. Des logiciels d’interprétation des séquences sont également disponibles. Pour confirmer un résultat, toute réaction de séquence d’un fragment d’ADN est systématiquement faite sur le brin sens et le brin antisens.

PCR sur colonies, principe de la polony et du séquençage sur polony. Un ensemble de molécules d’ADN issues d’une bibliothèque d’un ADN génomique (collection d’ADN) sur lesquelles ont été ajoutées des amorces universelles A et B en 3′ et 5′ par réaction de ligation sont incorporées dans un gel de polyacrylamide contenant tous les réactifs nécessaires à une PCR. Une seule molécule d’ADN est présente par site de dépôt dans le gel. L’amplification par PCR est donc réalisée dans le gel à partir d’une seule molécule. Chaque colonie correspond à une seule molécule d’ADN amplifiée par PCR. Après PCR, les colonies (polonies) sont dénaturées in situ et séquencées après addition d’une amorce de séquence. Le séquençage est réalisé par addition séquentielle et en série d’un seul nucléotide fluorescent (chaque nucléotide dA-, dG-, dC-, dTTP ayant une fluorescence spécifique). Après addition d’un nucléotide (par exemple, dATP), un lecteur type scanner lira la fluorescence si le nucléotide a été incorporé par l’ADN polymérase présente dans le gel. Après élimination par lavage des nucléotides non incorporés, le nucléotide suivant (par exemple, dCTP) est ajouté. La réaction continue.